Margarete wurde am 10. Januar 1480 in Brüssel geboren. Ihre Erziehung erhielt sie am französischen Hof, denn im Vertrag von 1482 wurde sie als 3-jährige mit Karl VIII. verheiratet. Die Ehe wurde jedoch aus politischen Gründen wieder aufgelöst, und Karl heiratete um 1493 Anna von Bretagne, worauf Margarete wieder zu ihrem Vater Maximilan I. zurückkehrte. Sie verlobte sich mit Johann von Spanien, welchen sie im Jahre 1497 ehelichte und der jedoch noch im selben Jahr verstarb. Margarete war schwanger von ihm und brachte das Kind kurz darauf zur Welt; es verstarb jedoch noch am Tag der Geburt.
Auch Margaretes zweiter Mann, Philibert II. von Savoyen, starb bereits drei Jahre nach der Hochzeit im Jahre 1504. Um 1507 wurde sie von ihrem Vater als Statthalterin in den Niederlanden eingesetzt, und dieses Amt führte sie mit grossem Eifer und Sorgsamkeit aus. Als engagierte Förderin der Künste genoss sie auch neben ihrem Amt als Statthalterin grosses Ansehen. Am 1. Dezamber 1530 starb Margarete in Mechelen an Wundbrand. Ihr Leichnam wurde später in einer Kirche in Bourg-en-Bresse beigesetzt, welche sie sich zu Lebzeiten als Grabmal hatte erbauen lassen.